一、WB實(shí)驗中的磷酸酶抑制劑的作用
細胞或組織裂解時(shí)會(huì )釋放出大量?jì)仍葱缘鞍琢姿崦?,以各種方式催化磷酸化蛋白的去磷酸化,從而影響后續的蛋白檢測。因此在提取物中適量添加外源性磷酸酶抑制劑,有利于在之后的Western blotting、免疫共沉淀檢測磷酸化蛋白質(zhì)和蛋白激酶活性測定等實(shí)驗過(guò)程中抑制磷酸化蛋白的去磷酸化,維持蛋白質(zhì)的磷酸化狀態(tài)。
二、WB實(shí)驗中的磷酸酶抑制劑的作用原理
在細胞信號轉導中,靶蛋白會(huì )被可將磷酸基團轉移到特定位點(diǎn)的蛋白激酶磷酸化。這些磷酸基團在細胞裂解時(shí)會(huì )被內源性蛋白磷酸酶去除。磷酸酶抑制劑有助于在細胞裂解和蛋白質(zhì)提取過(guò)程中保持磷酸蛋白的活性和狀態(tài)。
三、常用的磷酸酶抑制劑的分類(lèi)
常見(jiàn)的磷酸酶有蛋白酪氨酸磷酸酶、堿性磷酸酶和酸性磷酸酶,常用的磷酸酶抑制劑如下:
1. 氟化鈉(sodiμm fluoride):酸性磷酸酶可逆抑制劑;
2. 焦磷酸鈉(sodiμm pyrophosphate):絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶不可逆抑制劑;
3. β-甘油磷酸(β-glycerophosphate):絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶可逆抑制劑;
4. 正釩酸鈉(sodiμm orthovanadate):堿性磷酸酶和酪氨酸磷酸酶可逆抑制劑:
5. 鉬酸鈉(sodiμm molybdate):酸性磷酸酶不可逆抑制劑;
6. 二水酒石酸鈉(sodiμm tartrate dihydrate):酸性磷酸酶可逆抑制劑;
7. 咪唑(imidazole):堿性磷酸酶可逆抑制劑。
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