免疫組化，是應用免疫學(xué)基本原理-抗原抗體反應，即抗原與抗體特異性結合的原理，通過(guò)化學(xué)反應使標記抗體的顯色劑(熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色來(lái)確定組織細胞內抗原(多肽和蛋白質(zhì))，對其進(jìn)行定位、定性及相對定量的研究，稱(chēng)為免疫組織化學(xué)技術(shù)或免疫細胞化學(xué)技術(shù)。

一、SP法步驟

1. SP三步法

脫蠟→梯度水化→滅活內源性過(guò)氧化物酶→抗原修復→封閉→一抗孵育→二抗孵育→SP反應→DAB顯色→蘇木素復染→常規脫水→透明→封片

2、免疫組化的關(guān)鍵環(huán)節

①脫蠟和水化

②抗原修復

③滅活內源性過(guò)氧化物酶和生物素

④血清封閉

⑤一抗和二抗濃度和孵育時(shí)間

⑥切片清洗(浸洗、沖洗和漂洗)

⑦DAB顯色

⑧復染

⑨脫水透明

⑩封片

二、異常分析

1、非特異性染色

①抗體孵育時(shí)間過(guò)長(cháng)、抗體濃度高易增加背景著(zhù)色。這可通過(guò)縮短一抗/二抗孵育時(shí)間、稀釋抗體來(lái)控制。

②一抗用多克隆抗體易出現非特異性著(zhù)色，建議試用單克隆抗體。

③內源性過(guò)氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高(含血細胞多的組織)，需要通過(guò)延長(cháng)滅活時(shí)間和增加滅活劑濃度來(lái)降低背景染色。

④非特異性組分與抗體結合，這需要通過(guò)延長(cháng)二抗來(lái)源的動(dòng)物免疫血清封閉時(shí)間和適當增加濃度來(lái)加強封閉效果。

⑤DAB孵育時(shí)間過(guò)長(cháng)或濃度過(guò)高。

⑥PBS沖洗不充分，殘留抗體結果增強著(zhù)色，在一抗/二抗/SP孵育后的浸洗尤為重要。

⑦標本染色過(guò)程中經(jīng)常出現干片，這容易增強非特異性著(zhù)色。

2、呈陰性結果

①抗體濃度和質(zhì)量問(wèn)題以及抗體來(lái)源選擇錯誤。不是抗體濃度越高就越易出現陽(yáng)性結果，抗原抗體反應有前帶和后帶效應，必須摸索最佳濃度。

②抗原修復不全，對于甲醛固定的組織必須用充分抗原修復來(lái)打開(kāi)抗原表位，以利于與抗體結合。

③組織切片本身這種抗原含量低。

④血清封閉時(shí)間過(guò)長(cháng)。DAB孵育時(shí)間過(guò)短。

⑤細胞通透不全，抗體未能充分進(jìn)入胞內參與反應。

三、重要信息

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