細胞克隆形成實(shí)驗是用來(lái)檢測細胞增殖能力、侵襲性、對殺傷因素敏感性等項目的重要技術(shù)方法。

一、實(shí)驗原理

接種細胞后，只有同時(shí)具有貼壁和增殖活力的細胞才會(huì )形成克隆?？寺⌒纬陕史从臣毎莫毩⑸婺芰Φ膹娙?，用于評價(jià)細胞群體依賴(lài)性和增殖能力?？寺⌒纬陕逝c接種密度有一定關(guān)系，在進(jìn)行測定時(shí)需要將接種的單個(gè)細胞分散為懸液，并直接接種在培養皿中進(jìn)行持續一周以上的培養，并在此期間進(jìn)行檢查。當出現新的、由單個(gè)原始生長(cháng)出來(lái)的完整幾何結構時(shí)，則可以停止培養過(guò)程。

克隆形成依據采用的培養介質(zhì)的不同，分為平板克隆和軟瓊脂克隆兩類(lèi)。

二、實(shí)驗方法

1. 平板克隆實(shí)驗（以6孔板為例）

（1）將處于對數生長(cháng)期的細胞胰酶消化后，wanquan培養基（基礎培養基+10%胎牛血清）重懸成細胞懸液，并計數；

（2）細胞接種：于6孔板培養板中各實(shí)驗組接種400-1,000個(gè)細胞/孔（根據細胞生長(cháng)情況確定，一般為700個(gè)細胞/孔）;

（3）繼續培養到14天或絕大多數單個(gè)克隆中細胞數大于50為止，中途每隔3天進(jìn)行換液并觀(guān)察細胞狀態(tài)；

（4）克隆完成后，在顯微鏡下對細胞進(jìn)行拍照，然后PBS洗滌1次，每孔加入1 mL 4%多聚甲醛固定30-60 min，PBS洗滌1次；

（5）每孔加入結晶紫染液1ml，染細胞10-20 min；

（6）PBS 洗滌細胞數次，晾干，數碼相機拍照（分別對整個(gè)六孔板及每個(gè)孔進(jìn)行單獨拍照）。

2. 軟瓊脂克隆實(shí)驗

（1）配制1.2% 和0.7%瓊脂，高壓滅菌后，維持在42℃中使其不會(huì )凝固；

（2）將1.2% 瓊脂與2×培養基混合，鋪入6孔板作為下層膠，每孔1.5ml，37°C孵育30 min使之凝固；

（3）將制備好的單細胞懸液與0.7%瓊脂充分混勻，加入6孔板作為上層膠，每孔1.5ml。待其凝固后，再在上面加入培養基，每3天更換一次；

（4）根據細胞的生長(cháng)速度培養2~3周后顯微鏡下觀(guān)察克隆大小，與平板克隆一樣，每個(gè)克隆>50個(gè)細胞，顯微鏡拍照。若拍整個(gè)孔，每孔加入200μl氯化硝基四氮唑藍（NBT）染色，37°C過(guò)夜，拍照。

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