在上篇MLPA試驗原理中，我們已經(jīng)詳細介紹了MLPA技術(shù)。MLPA，即多重連接探針擴增技術(shù)，是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于檢測基因的拷貝數變異和序列變異。它結合了PCR（聚合酶鏈式反應）和連接酶技術(shù)，通過(guò)設計特定的探針來(lái)識別和擴增目標DNA序列。下面讓我們一起來(lái)看看MLPA的試驗步驟吧！

MLPA試驗步驟分為六步：變性、雜交、連接、PCR擴增、片段分離、數據分析。

一、變性

將DNA標本放入PCR儀中加熱5分鐘，使DNA雙鏈解鏈成單鏈。純化的樣本DNA被變性。

二、雜交

加入雜交反應液。雜交反應液包含SALSA MLPA探針混合液和SALSA MLPA緩沖液。每組MLPA探針混合物包含多達60對不同的MLPA探針，每個(gè)探針識別一個(gè)特異的靶序列。MLPA探針由兩部分組成:左探針和右探針寡核苷酸(LPO和RPO)。LPO和RPO包含PCR引物和DNA雜交序列。在MLPA反應中，左探針寡核苷酸（LPO）和右探針寡核苷酸（RPO）都與靶序列進(jìn)行雜交。

三、連接

實(shí)驗第二天，加入連接酶反應液。反應液包括連接酶緩沖液A，連接酶緩沖液B和SALSA連接酶Ligase-65。連接酶Ligase-65結合到與靶序列雜交的左側探針和右側探針上，催化產(chǎn)生一個(gè)共價(jià)鍵。隨后，通過(guò)加熱反應液使連接酶失活，從而終止連接步驟。連接酶Ligase-65特異性非常高，只要雜交區域有一個(gè)核苷酸錯配，連接酶就不會(huì )連接兩段探針，使連接反應具有高度特異性。正是由于這種高特異性，MLPA也可以用于區分序列高度相似的假基因，以及檢測特定的點(diǎn)突變。

四、PCR擴增

加入PCR聚合酶混合液。PCR聚合酶混合液包含SALSA PCR聚合酶及SALSA PCR引物混合液。PCR引物混合液中包含dNTPs、正向引物和反向引物。正向PCR引物帶有熒光標記。所有連接上的MLPA探針均使用這對PCR引物進(jìn)行指數擴增。PCR反應包含變性、引物復性以及引物延伸，循環(huán)35次。熒光標記被帶入到MLPA擴增產(chǎn)物，即MLPA擴增子中。

五、片段分離

擴增后，用毛細管電泳分離片段。毛細管電泳根據片段的長(cháng)度進(jìn)行分離，并將不同長(cháng)度的片段顯示為峰值模式，稱(chēng)為電泳圖。

六、數據分析

每個(gè)探針上的填充序列不同，每個(gè)擴增子都有不同的已知大小，因此在數據分析過(guò)程中可以對每個(gè)擴增子進(jìn)行量化。毛細管電泳得到的數據將作為分析的輸入，輸入數據分析軟件Coffalyser。通過(guò)將每個(gè)樣本與一組參考樣本進(jìn)行比較，我們可以得到一個(gè)探針比，這個(gè)探針比率將告訴我們一個(gè)基因有多少個(gè)拷貝數。由于大多數人類(lèi)基因是二倍體，如果樣本有兩個(gè)拷貝，比例將為1.0，即樣本探針獲得的基因數量與參考樣本相同。如果比值為0.5，則該基因在個(gè)體中只有一個(gè)拷貝，這可能意味著(zhù)目標基因的雜合缺失。另一方面，如果這個(gè)比率是1.5，那么很可能存在一個(gè)基因的雜合復制。