產(chǎn)品名稱(chēng)：碧云天LipoInsect轉染試劑(C0551-7.5ml)現貨供應

產(chǎn)品貨號：C0551

產(chǎn)品品牌：碧云天

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

碧云天LipoInsect轉染試劑是一種基于陽(yáng)離子脂質(zhì)體等最新轉染技術(shù)的非常高效的新型昆蟲(chóng)細胞轉染試劑。本產(chǎn)品轉染效率高、操作簡(jiǎn)單、細胞毒性低、重復性好，達到了國際最主流昆蟲(chóng)細胞轉染試劑的轉染效果。
本產(chǎn)品適用于將pFastBac1等桿狀病毒表達載體質(zhì)粒DNA轉染到Sf9、Sf21和High Five™等昆蟲(chóng)細胞以用于Bac-to-Bac®、BaculoDirect™和InsectSelect™表達系統的蛋白表達。
Bacmid轉染：
1. 昆蟲(chóng)細胞培養(以六孔板為例，其它培養板或培養皿可參考六孔板)：按照每孔約80萬(wàn)Sf9或Sf21細胞(具體的細胞數量據細胞類(lèi)型、大小和細胞生長(cháng)速度等而定)用正常的細胞培養液接種到六孔板內，使細胞密度能達到約70-90%。在27-28℃培養，后續轉染和培養也在該溫度下進(jìn)行。
2. 15分鐘后，將正常的細胞培養液更換為平板培養液(含1.5%胎牛血清不含抗生素的SFX-INSECT培養液)每孔0.8ml。

3. 對于待轉染的六孔板中每一個(gè)孔的細胞，取兩個(gè)潔凈無(wú)菌離心管，分別加入100μl不含血清和抗生素的SFX-INSECT昆蟲(chóng)細胞培養液用于稀釋bacmid和轉染試劑。其中一管加入16μg bacmid，并用槍輕輕吹打混勻；另一管加入8μl LipoInsect™轉染試劑，用槍輕輕吹打混勻，或者輕微Vortex混勻，但不可離心。稀釋的bacmid和轉染試劑室溫靜置約2-5min(最多不得超過(guò)30分鐘)。隨即把稀釋的bacmid用移液器輕輕加入到稀釋的LipoInsect™轉染試劑中，輕輕顛倒離心管或者用槍輕輕吹打混勻，室溫靜置15-30分鐘。

4. 按照六孔板每孔200μl LipoInsect™轉染試劑-bacmid混合物的用量，均勻滴加到整個(gè)孔內，隨后輕輕混勻。
5. 為達到最高的轉染效率，細胞在轉染后培養3-5小時(shí)后宜更換為新鮮的wan全培養液(對于Sf9細胞，推薦在轉染4小時(shí)后更換培養液)。
6. 繼續在27-28℃培養約96小時(shí)后，收集每孔的培養液，500g離心5分鐘，獲得的上清即為P1代桿狀病毒(病毒滴度通常為1×10⁶~1×10⁷ pfu/ml)。P1代病毒4℃避光保存，如果包裝病毒時(shí)的細胞培養液為無(wú)血清培養液宜添加胎牛血清至終濃度為2%以保護病毒被蛋白酶降解。P1代病毒近期不使用的情況，可以適當分裝后-80℃長(cháng)期保存。盡量避免反復凍融病毒，反復凍融可能導致病毒滴度下降10-100倍。
7. 為獲得更高滴度的桿狀病毒，可以使用P1代病毒感染Sf9或Sf21細胞等來(lái)獲得P2代桿狀病毒(病毒滴度通常為1×107 ~1×108
pfu/ml)。具體操作請參照昆蟲(chóng)細胞Bac-to-Bac Baculovious expression system的相關(guān)操作規程。大致的步驟為使用P1代病毒感染2×106個(gè)貼壁約1小時(shí)的Sf9或Sf21細胞，推薦的病毒的MOI為0.05-0.1，過(guò)高的MOI會(huì )導致獲得的病毒質(zhì)量下降。27-28℃培養48小時(shí)后，同步驟f收集每孔的培養液，隨后500g離心5分鐘，獲得的上清即為P2代桿狀病毒。P2代病毒的保存條件同P1代。由于桿狀病毒在每一代的擴增過(guò)程中均易出現缺少突變，因此推薦最多擴增至P3代病毒。

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