Elabscience®自主研發(fā)的 Annexin V-FITC/PI Apoptosis Kit，可用于檢測懸浮細胞和貼壁細胞的凋亡。Annexin V是一種鈣離子依賴(lài)性磷脂結合蛋白，與磷脂酰絲氨酸 (PS) 有高度親和力。當細胞發(fā)生凋亡時(shí)，膜內側的磷脂酰絲氨酸 (PS) 外翻到膜表面，而被熒光染料 FITC 標記的Annexin V結合，可通過(guò)流式細胞儀或熒光顯微鏡進(jìn)行檢測。由于凋亡晚期或壞死細胞膜喪失完整性，而碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）可與雙鏈 DNA 特異性結合并產(chǎn)生強烈的熒光，與 Annexin V搭配使用，可區分處于不同凋亡時(shí)期的細胞。本試劑盒檢測喜樹(shù)堿誘導的Jurkat細胞凋亡效果如下圖所示：

實(shí)驗操作：

一步法

1．細胞按照實(shí)驗方案進(jìn)行凋亡誘導，300 ×g 離心 5 min，棄上清，收集細胞，PBS 洗滌一次，輕輕重 懸細胞并計數。

2．取 1~5 × 105 重懸的細胞，300 ×g 離心5 min，棄上清。用 PBS 洗滌細胞一次，離心后棄上清，加入500 μL稀釋的1 × Annexin V Binding Buffer 重懸細胞。

3．細胞懸液中加入5μL的Annexin V-FITC Reagent和5μL的PI Reagent (50μg/mL)。

4． 輕柔渦旋混勻后，室溫避光孵育 15~20 min。

5． 立即上機檢測。如不能及時(shí)檢測，請于冰上避光靜置并于1小時(shí)內完成檢測。

注：流式細胞儀檢測時(shí)Annexin V-FITC可用FITC通道，PI優(yōu)先選擇 PerCP/Cy5.5 通道，其次是ECD通道。

兩步法

1．細胞按照實(shí)驗方案進(jìn)行凋亡誘導，300×g離心5 min，棄上清，收集細胞，PBS 洗滌一次，輕輕重懸細胞并計數。

2．取1~5 × 10⁵重懸的細胞，300 ×g離心5 min，棄上清。用PBS洗滌細胞一次，離心后棄上清，加入100 μL稀釋的1 × Annexin V Binding Buffer重懸細胞。

3．細胞懸液中加入2.5 μL的Annexin V-FITC Reagent和2.5μL的PI Reagent (50μg/mL)。（由于兩步法 分辨率更高，染色液用量減半依然可得到媲美一步法的效果；用戶(hù)亦可根據自己的模型進(jìn)行滴定后加入適量的染色液，用更少的量獲得高質(zhì)量的結果。）

4．輕柔渦旋混勻后，室溫避光孵育15~20 min。

5．加入400 μL稀釋的1 × Annexin V Binding Buffer，混勻樣本。

6．立即上機檢測。如不能及時(shí)檢測，請于冰上避光靜置并于 1 小時(shí)內完成檢測。

注：流式細胞儀檢測時(shí)Annexin V-FITC可用FITC通道，PI 優(yōu)先選擇 PerCP/Cy5.5 通道，其次是ECD通道。

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