免疫熒光（IF）是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎上建立起來(lái)的一項檢測技術(shù)?？捎糜跈z測和識別細胞和組織中蛋白質(zhì)及其他分子的亞細胞分布和遷移。那么你知道免疫熒光實(shí)驗的注意事項有什么嗎？讓我們一起來(lái)看看吧！

一、設置對照

可以使用陽(yáng)性和陰性對照來(lái)確定結果的準確性，并幫助確定任何問(wèn)題的來(lái)源。

二、樣品和試劑的存儲

由于IF中所用抗體和實(shí)驗樣品的熒光性質(zhì)，因此必須適當存儲。最好將熒光抗體和經(jīng)過(guò)IF處理的樣品都保存在wan全黑暗的環(huán)境中。使用琥珀色或鋁箔覆蓋抗體管。

三、使用適當的固定劑

醛可用于標記膜結合抗原或細胞骨架抗原，并應用于核蛋白或線(xiàn)粒體蛋白。醛固定后的樣本需要抗原修復和打孔滲透步驟才能正確檢測抗原。如果使用單克隆抗體推薦有機溶劑用于組織固定。甲醇適用于冷凍樣本的固定；丙酮固定對組織學(xué)保存效

四、仔細選擇抗體

應檢查所有抗體，無(wú)論是單克隆抗體還是多克隆抗體，以確保與目標抗原具有高的親和力。所用的二抗必須與一抗兼容，比如使用抗小鼠二抗檢測小鼠來(lái)源的一抗。

五、多色染色

最好使用在不同物種中產(chǎn)生的一抗。如果使用間接檢測，請使用已預先吸附在檢測其他蛋白質(zhì)的一抗和二抗的種屬以及實(shí)驗樣品的物種中的二抗。這樣可以zui大程度地減少跨物種的反應性和非特異性結合。所有二抗也應在同一物種中產(chǎn)生，以zui大程度地減少交叉反應。

六、決定直接或間接染色

兩種方法都有優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，根據實(shí)驗需求選擇。使用這兩種方法，都應該確保充足的洗滌以最小化非特異性的結合。

七、選擇沒(méi)有光譜重疊的熒光團

IF是一種很好的多路復用分析技術(shù)，測量如此多的參數，那么使用能夠提供可分辨信號的熒光團是很有必要的。

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