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你知道WB實(shí)驗操作步驟有哪幾步嗎?

 更新時(shí)間:2023-09-22 點(diǎn)擊量:1060

蛋白質(zhì)印跡(Western blotting):又稱(chēng)為免疫印跡,根據抗原抗體的特異性結合,半定量檢測樣品中的某種蛋白的方法?;驹硎峭ㄟ^(guò)特異性抗體對凝膠電泳處理過(guò)的細胞或生物組織樣品進(jìn)行著(zhù)色。通過(guò)分析條帶的位置和條帶深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細胞或組織中表達情況。那么你知道WB實(shí)驗操作步驟有哪幾步嗎?讓我們一起來(lái)看看吧!

一、樣本制備蛋白提取

1.前期準備:首先要了解你所研究蛋白的內源表達水平,常用的數據庫如Uniport、Atlas、BioGPS,或查閱相關(guān)文獻。設置陽(yáng)性對照,選擇內參蛋白。

2.蛋白提?。菏荳estern Blotting 的第一步,要求選擇樣本新鮮,降低背景,避免反復凍融,選擇合適的裂解液裂解樣本,選擇合適的蛋白酶或磷酸酶抑制劑,防止蛋白的降解和磷酸化信號的丟失。

二、蛋白濃度測定

蛋白質(zhì)濃度測定的方法包括Lowry法、Bradford法、BCA法,常用的是BCA法,基本原理是在堿性條件下,蛋白將Cu+ +還原為Cu+,Cu+ 與BCA試劑形成紫顏色的絡(luò )合物,測定其在562nm處的吸收值,并與標準曲線(xiàn)對比,即可計算待測蛋白的濃度。

之后加入Loading buffer,含有變性劑,使蛋白質(zhì)變性,釋放二硫鍵,最后煮沸變性保存樣品于-20℃或-80℃。

三、上樣和電泳

1. 制備凝膠:根據蛋白分子量的大小,選擇合適濃度的分離膠,配膠的APS需要在4℃的冰箱中保存。配膠的試劑中,APS與TEMED是促凝劑,所以在加促凝劑之前,需先把其他組分混勻。

2.上樣:蛋白Marker孔加入5-10μL,多選擇生物素化蛋白Marker,其余蛋白總上樣量20-50μg,組織樣本稍多些上樣,盡量保持每個(gè)泳道的上樣量一致,空泳道用Loading buffer補齊。

3. 電泳:接上電源后,先用80V恒壓電泳濃縮至溴酚藍指示劑到濃縮膠與分離膠交界處,成線(xiàn)狀,改為恒壓100v--120v直至溴酚藍電泳到凝膠底部,此過(guò)程約用時(shí)1.5h。

四、轉膜

1.膜的選擇:廣泛使用的是NC膜和PVDF膜

2.轉膜:轉膜的方法包括濕轉、半干轉、干轉,濕轉是轉膜最完quan且應用zui廣泛的方法,但是所需時(shí)間較長(cháng)。

五、封閉和抗體孵育

1.封閉:目的是為了減少膜對一二抗的非特異吸附,降低背景。將NC膜從濕轉系統中取出,并用TBST潤洗2次,每次5 min,然后進(jìn)行封閉。

化學(xué)發(fā)光法:用含5% 脫脂奶粉的TBST(封閉液)浸泡NC膜,室溫搖床封閉1-2h;

熒光法:含5% 脫脂奶粉的TBS,脫脂奶粉需選擇實(shí)驗室級別的。

最后再用TBST潤洗封閉后的NC膜3次,每次5 min。

2.抗體孵育:一抗能識別膜上不同種屬的蛋白,買(mǎi)經(jīng)過(guò)驗證的,二抗上帶有發(fā)光底物,只能識別一抗。

六、顯色曝光

常用的是化學(xué)發(fā)光,抗體上偶聯(lián)的HRP催化ECL發(fā)光底物顯色,取出洗滌的膜后,用濾紙吸干水分,放置于成像儀上,均勻滴加ECL工作液,排出氣泡,開(kāi)始曝光。

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