熒光素是一種常見(jiàn)的生物發(fā)光報告子，用于體外成螢光素酶。這種螢火蟲(chóng)螢光素酶的水溶性底物（通常來(lái)自Photinuspyralis）

利用ATP和Mg2+作為共因子在氧氣的存在。通過(guò)ATP的利用，反應可以進(jìn)一步用于指示能量或生命的存在是為了起到生死攸關(guān)

的污點(diǎn)的作用。

螢火蟲(chóng)螢光素酶是研究基因最chang用的報告基因之一表達由于其ji端的敏感性，以及快速，易于使用的系統。螢光素酶用于監測

細菌、培養細胞以及轉基因植物或動(dòng)物。它是一種約61kDa的蛋白質(zhì)，作為單體具有活性，不需要加工其活動(dòng)。螢火蟲(chóng)螢光素

酶通過(guò)催化熒光素的氧化羧化作用產(chǎn)生具有任何已知生物發(fā)光中最gao效率之一的反應。螢光素活性可以通過(guò)與啟動(dòng)子/增強子的

相關(guān)性來(lái)表征基因調控元素。優(yōu)化后化學(xué)發(fā)光反應和調節元件的轉錄活性。

本手冊旨在介紹一種簡(jiǎn)單、經(jīng)濟、可靠的方法，用于在體外報告系統中檢測熒光素酶活性。

生物發(fā)光反應：

幾個(gè)因素可能會(huì )影響反應的靈敏度，包括溫度、pH或底物濃度我們建議使用pH為7.8的緩沖液，并在使用前將所有試劑預熱至

室溫，以獲得最佳結果。GoldBio還建議添加在測定緩沖液中過(guò)量的ATP和Mg2+用于更好的反應。

當熒光素被添加到螢光素酶樣品中時(shí)，會(huì )立即產(chǎn)生閃光在0.3-0.5秒內達到峰值強度。然后，光線(xiàn)開(kāi)始迅速衰減一半壽命約為0.5

-1.0分鐘。但當輔酶A最初加入測定緩沖液時(shí)能夠防止快速反應衰變延長(cháng)了反應2-5分鐘。如果稍后添加到反應中混合物，輔酶A也促進(jìn)額外的二次閃光。

Gold Bio推薦基于Yuichi Oba等人（2003）：

-100mM Tris-HCl（pH 7.8）

-5mM MgCl2

-250μM CoA

-150μM ATP（Fraga，2008）

-150μg/mL d-熒光素（GoldBio）

一些研究人員還添加了二硫蘇糖醇（DTT）或EDTA等成分（Steghans，1998）。您可以調整您的特定分析緩沖液以達到最佳

效果滿(mǎn)足您的需求。我們建議對您的特定細胞進(jìn)行動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)的初步測試以獲得最佳效果。

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