胺基活化的瓊脂糖可以用于含羧基或含醛的分子。耦合化學(xué)是基于碳二亞胺的，是一項成功且有據可查的技術(shù)。

胺基活化瓊脂糖色譜填料(Amine-activated SepFast)與含有羧基的配體形成化學(xué)穩定的酰胺鍵，它有一個(gè)長(cháng)間隔區（9個(gè)原子）。預活化的瓊脂糖基質(zhì)可以用于制造各種定制的親和色譜吸附劑，適用于小規模和大規模純化應用。

1. 屬性

胺基活化瓊脂糖色譜填料(Amine-activated SepFast 4 High Flow)由高度交聯(lián)的4%珠狀瓊脂糖制成。它具有高機械剛度，可在降低背壓的情況下實(shí)現高流量。

由于瓊脂糖具有出色的親水性和低非特異性結合特性，長(cháng)期以來(lái)一直用于色譜分離。這些顆粒具有開(kāi)孔結構，對大蛋白質(zhì)分子具有出色的傳質(zhì)性能。

通過(guò)在末端連接帶有胺基的長(cháng)親水鏈來(lái)激活基礎基質(zhì)。在碳二亞胺試劑存在下與含羧基配體反應，或在還原劑存在下與含醛配體反應。胺基活化瓊脂糖色譜填料(Amine-activated SepFast)以20%乙醇中的水懸浮液形式提供。

表1  胺基活化瓊脂糖色譜填料(Amine-activated SepFast)的特性

2. 配體固定化

以下是含羧基配體一般的偶聯(lián)流程。

2.1  將目標配體溶解在偶聯(lián)緩沖液中，將pH值調整為4.5。偶聯(lián)緩沖液的體積可以是固定凝膠體積的一半或相同。

2.2  在過(guò)濾裝置中用至少5 倍體積的偶聯(lián)緩沖液清洗胺活化凝膠。

2.3  將洗凈并吸干的凝膠（來(lái)自步驟 2.2）轉移到步驟2.1 制備的溶液中。

2.4  將碳二亞胺作為干粉或預先溶解的溶液添加到漿液中，最終濃度為0.1 M。如果碳二亞胺預先溶解在水中，則將pH值調整為4.5。

2.5  在室溫或4-8℃下混合漿料。

2.6   在第1個(gè)小時(shí)內通過(guò)添加 0.1  M NaOH調節反應pH值至4.5。

2.7 將偶聯(lián)反應放置2-24小時(shí)。

2.8 用5倍體積的0.1 M 醋酸鹽緩沖液 + 0.5 M NaCl，pH 4.0洗滌凝膠，然后用5倍體積的0.1 M Tris/HCl + 0.5 M NaCl，pH 8.0洗滌凝膠。重復上述洗滌2次以上。

2.9 使用前用工作/平衡緩沖液清洗凝膠。

3. 固定化效率的一般考慮

3.1 pH

偶聯(lián)反應在pH 4.5 - 7.5之間非常有效地進(jìn)行。但是可以?xún)?yōu)化偶聯(lián)pH以獲得最佳結果（例如，高偶聯(lián)產(chǎn)率和高配體活性）。

在偶聯(lián)反應的第1個(gè)小時(shí)內，pH值會(huì )降低。要記得通過(guò)添加0.1 M NaOH來(lái)調節偶聯(lián)pH值。之后pH值會(huì )趨于穩定。

3.2 偶聯(lián)方案

去離子水可直接用作偶聯(lián)溶液。應避免使用含有氨基、巰基或羧基的緩沖溶液，因為它們會(huì )與配體偶聯(lián)發(fā)生競爭。

可以引入稀釋的某些有機溶劑以提高配體的溶解度。應事先測試此類(lèi)溶劑的適用性。

3.3 碳二亞胺的選擇

應使用水溶性碳二亞胺，例如1?乙基?3?(3?二甲基氨基丙基)碳二亞胺  (EDC)  或1?環(huán)己基?3?(2?嗎啉代乙基) 碳二亞胺  (CMC)（通常合成為 metho?p?甲苯磺酸鹽）。EDC是常用的碳二亞胺試劑。

3.4 碳二亞胺的濃度

添加的碳二亞胺的量應以化學(xué)計量的方式超過(guò)活化的胺基。建議以最終反應漿料中的0.1  M作為起點(diǎn)。

3.5 反應時(shí)間和溫度

可以?xún)?yōu)化偶聯(lián)過(guò)程中配體和活化填料之間的接觸時(shí)間以保持配體的生物活性。

典型的反應時(shí)間是在室溫或冷藏室中過(guò)夜。

3.6 屏蔽剩余的活化配體

如果加入過(guò)量的配體，則可能不需要封閉殘留的活化基團。

未與配體反應的活化基團應在碳二亞胺存在下通過(guò)添加含有pH 8 - 9伯胺的額外小分子（例如1 M乙醇胺）來(lái)封端。

3.7 最終填料的洗滌

偶聯(lián)反應后需要將未連接或弱連接的配體WAN全洗掉。采用高pH值和低pH值交替的洗滌方法可以確保有效去除不需要的物質(zhì)。

4. 固定化親和填料的使用

配體偶聯(lián)填料可用于使用間歇攪拌罐模式或填充柱模式的純化。處理這種材料遵循與處理其他基于瓊脂糖基質(zhì)相同的原則。

5. 儲存

胺基活化瓊脂糖色譜填料(Amine-activated SepFast)應在8℃下儲存。偶聯(lián)的濕填料應在防菌劑（例如20%乙醇）存在的情況下于4-8℃儲存。切勿凍存耦合填料。

6. 更多信息

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