細胞污染問(wèn)題分析解決

細胞轉染時(shí)，細胞狀態(tài)的好壞對轉染效率有很大影響。細胞污染可能會(huì )導致細胞死亡，本文主要總結了細胞培養中常見(jiàn)污染現象和解決方法。

凡是對細胞生長(cháng)有危害的成分或者造成細胞不純的異物都視為污染。細胞污染根據污染源可以分為化學(xué)污染，物理污染和生物污染。本文主要描述微生物污染的現象及解決方法

微生物污染

1. 細菌：細菌污染常見(jiàn)的有大腸桿菌，葡萄球菌等。細菌污染較易發(fā)現，在普通倒置顯微鏡下為黑色細沙狀，培養液一般會(huì )在短時(shí)間內變黃，有時(shí)靜置的培養液不混，稍加震蕩，變會(huì )有很多混濁物漂起。顯微鏡下可見(jiàn)培養液中有大量圓球狀顆粒物漂浮，有時(shí)在細胞表面及周?chē)写罅考毦嬖?，細胞停止生長(cháng)并有中毒表現。

處理：① 在培養液中加入相應的抗生素，能夠預防絕大多數的細菌污染

②保證器皿、水充分滅菌，空氣無(wú)菌，同時(shí)保證滅菌壓力。
2、霉菌：霉菌的污染多數是白色念珠菌， 曲霉菌，酵母菌等。霉菌污染后培養液短期內依舊清亮不變渾濁，倒置顯微鏡下可看見(jiàn)細胞之間有交錯的絲狀，樹(shù)枝狀菌絲，漂浮在培養液中。念珠菌呈卵圓狀，在細胞周邊生長(cháng)。細胞被霉菌污染后，仍可生長(cháng)，長(cháng)時(shí)間細胞的活力狀態(tài)會(huì )變差。

處理：先確定污染物的種類(lèi)：細菌、真菌還是支原體。如果是霉菌污染。迅速將污染細胞與正常細胞系隔離，并對實(shí)驗中所用過(guò)的所有器皿工具消毒

3、支原體：支原體的大小介于細菌和病毒之間，是一種獨立生活的微生物。對熱敏感，對一般抗生素不敏感。支原體的形態(tài)多變，多吸附在細胞表面和細胞之間。電鏡下觀(guān)察，中心有高密度的密集顆粒，橫斷面與細胞微絨毛相似。

因國內的血清很多數都沒(méi)有做支原體陰性檢測，而支原體又是牛血清中常見(jiàn)的微生物之一。支原體污染細胞后，培養液輕微發(fā)生混濁．但細胞變化不顯著(zhù)，在細胞逐漸的培養中，細胞會(huì )慢慢死亡。

支原體污染檢測：

熒光染色法：DNA和與DNA特異性結合的熒光染料結合，使得支原體的DNA著(zhù)色，然后用熒光顯微鏡觀(guān)察。鏡下支原體為散在于細胞同圍或附于細胞膜表面的亮綠色小點(diǎn)。

解決：① 抗生素排除法：支原體污染預防比解決好。如果不小心污染后，可加入高濃度抗生素（常規使用的5倍濃度）作用24-48小時(shí)，再換入常規培養液，但該法不保證有效。推薦用量：慶大霉素 200ug/ml ,四環(huán)素10ug/ml ，卡那霉素50ug/ml 。

2 加溫除菌：支原體不耐熱，可以對支原體污染的細胞熱處理除菌。將支原體污染的細胞放置41度中作用10小時(shí)可殺死支原體。因高溫對細胞本身也會(huì )產(chǎn)生一定影響，故熱處理前需行預實(shí)驗，確定對細胞影響小而能大程度的殺死支原體的時(shí)間。
4、黑蛟蟲(chóng)：黑膠蟲(chóng)污染后細胞中出現小黑點(diǎn)，高倍鏡下可看見(jiàn)不規則的運動(dòng)。培養液渾濁不明顯，對細胞生長(cháng)狀態(tài)無(wú)太大影響。

解決：如果細胞出現黑膠蟲(chóng)污染，可增加細胞的接種密度，提高細胞存活率。當細胞生長(cháng)狀態(tài)很好時(shí)，黑膠蟲(chóng)的數量會(huì )降低。細胞培養過(guò)程中堅持要每天換液，并用緩沖液沖洗，能夠大大降低黑膠蟲(chóng)的數量，可終消失，偶爾在鏡下可見(jiàn)個(gè)別小黑點(diǎn)，但整體細胞培養和后續的細胞轉染無(wú)影響。

細胞培養箱染菌清洗方法

用硫酸銅溶液擦拭CO2孵箱內，再把水盤(pán)里也加上飽和量的硫酸銅?；蛘咴谂囵B箱的托盤(pán)加入飽和的消毒磷酸氫二鈉高鹽液體,可以防止霉菌污染。
CO2孵箱被霉菌污染后，可把所有細胞暫時(shí)轉移，采用過(guò)氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。并把過(guò)氧乙酸放置在孵箱內一個(gè)小時(shí)，使其蒸汽彌漫。待過(guò)氧乙酸的氣味消散后，再移入細胞。孵箱應定期清潔（2月左右）。
其它培養箱清洗方法是：用84液擦洗－清水擦洗－75%酒精擦洗－紫外燈照。
預防霉菌污染，可在培養基里加3u/ml的兩性霉素或制霉菌素或放線(xiàn)菌素D或雙抗；但細胞一旦污染，制霉菌素或放線(xiàn)菌素D或雙抗都無(wú)法彌補，舍棄被污染細胞，并將環(huán)境*消毒。如果所有細胞都污染，可能是整體系統污染，檢查所有培養基和器材，并重新滅菌。針對個(gè)別污染，先考慮操作問(wèn)題，注意操作規范。